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全光谱流式细胞仪的黑科技：NovoCyte Opteon 破解光谱重叠密码！
在流式细胞术的世界里，荧光染料的选择和组合一直是实验设计中的关键环节。传统流式细胞仪依赖于荧光补偿来校正光谱溢出，但这种方法在面对光谱高度重叠的荧光染料时往往力不从心。然而，随着全光谱流式细胞仪的出现，这一难题终于迎来了突破性的解决方案。
安捷伦 NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪，作为安捷伦细胞分析领域的旗舰产品，以其卓越的光谱解析能力，正在重新定义多色流式细胞术的可能性。它集多项技术创新于一体，配备多达 5 个激光器和 73 个检测器，并采用创新的光学设计以及先进的电子器件和信号处理算法，能够提供高分辨率和高灵敏度的数据。本文详细介绍了 NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪在具有高度重叠光谱的相似荧光染料的解析能力应用。
安捷伦 NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪
应用简介
01
全光谱流式细胞仪采用?系列光电探测器和相应的窄带通滤光片或衍射光栅，使用多个激光器在整个光谱范围内测量荧光染料的全发射光谱。与传统的流式细胞术通过补偿来校正荧光光谱不同，光谱流式细胞术利?光谱解混来解析单个荧光染料的信号强度。该过程采??种数学算法，基于每种荧光染料独特的光谱特征，将多色样本的光谱特征分解为?组荧光染料及其相应的丰度。该?法能够区分峰值发射几乎相同但?峰值发射不同的荧光染料，?这对于传统流式细胞仪来说通常是?项巨大的挑战。
在本应?中，我们展?了安捷伦 NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪利?精心设计的多色组合来解析光谱相似的荧光染料的能?。尽管这些荧光染料的光谱?度重叠，但它们在同一 panel 中使?时仍能被有效地分辨出来，这证明了 NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪卓越的光谱分辨能?。这种能?扩展了更为灵活的荧光染料选择的可能性，从?能够在同? panel 中分析更多的生物标志物。
02
在传统流式细胞术中，发射峰接近的荧光染料会在同?通道中被检测到，因此无法同时使?。例如，APC 和 AF647 的最?发射波长分别为 660 nm 和 671 nm（图 1A），通常会在红色激光器激发的中心波长约为 660 nm 的同?个通道中被检测到。然?，光谱流式细胞术会捕获整个光谱范围内所有可?激光器对该荧光染料激发的发射谱。然后，使?光谱解析技术，根据每种荧光染料独特的光谱特征来确定其在各个通道上的贡献，使得我们能够区分每个荧光染料。以 APC 和 AF647 为例，它们的发射光谱在红色激光器激发的通道中?常相似，仅在 R661 和 R681 通道中略有差异，但在其他激光器激发的通道中，尤其是在紫外 (UV)、紫色和蓝色通道中，它们表现出显著差异。这些差异使得光谱解混能够轻松区分它们的信号。其他?例包括 PerCP?Cy5.5/PerCP?eFluor710（图 1B）、PerCP?Cy5.5/PE?Cy5.5（图 1C）、BV421/Pacific Blue（图 1D）、Qdot705/BV711（图 1E）和 BB515/FITC（图 1F）。
图 1. 对具有相似光谱特征的荧光染料组合的检测。这些组合包括：APC/ Alexa Fluor 647（A）、PerCP?Cy5.5/PerCP?eFluor 710（B）、PerCP?Cy5.5/PE?Cy5.5（C）、BV421/Pacific Blue（D）、Qdot705/BV711（E）和 BB515/FITC（F）。对照组：未包含具有相似光谱特征的荧光染料。测试组：包含具有相似光谱特征的荧光染料。
03
虽然光谱解析可以根据荧光染料的光谱特征区分荧光染料的信号，但在测量多种荧光染料时，同样存在光谱溢出扩散误差，光谱解析无法消除这些溢出扩散误差。光谱越接近，荧光染料之间的溢出扩散误差就越?。这?现象强调了在 panel 设计中选择光谱重叠最?的荧光染料以减少溢出扩散的重要性。本?，我们首先使?安捷伦 NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪展?了几个包含光谱相似的荧光染料的组合，并与相同标记偶联光谱不同的荧光染料的 panel 进行了平行?较。光谱相似的荧光染料组合包括 BB515/FITC、Pacific Blue/BV421、APC/Alexa Fluor 647、PerCP?Cy5.5/PE?Cy5.5 和 PE?Cy5.5/PE?AF700。尽管光谱相似的荧光染料的溢出扩散要?得多，但这些组合中的荧光染料?起使?时可以被很好的分辨出来。其次，我们使? NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪将 FITC 与不同的光谱相似的荧光染料进行了?较。随着相似度的增加，荧光信号扩散显著增加，FITC 的分辨率相应降低。当 FITC 与 Alexa Fluor 488 或 KB520 ?起使?时，相似度指数为 1.00，这表明它们的光谱几乎完全相同，由于相似度过?，信号分辨率受到了影响。最后，我们使?了混合不同荧光染料的补偿微球，这些荧光染料由同?激光器（405 nm 紫色、488 nm 蓝色或 640 nm 红色）激发，以模拟多种荧光染料同时使?的情况。在这种情况下，NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪能够有效区分多种荧光染料的信号。
讨论
1
具有相似光谱特性的荧光染料组合?例
我们设计了几个包含相似光谱特性的荧光染料的检测组，并与相同标记物偶联光谱不同的荧光染料的检测组进行了平行对比。相似指数（范围从 0 到 1）用来衡量?个光谱特征与另?个光谱特征的相似程度。接近 0 的值表?特征差异很?，?接近 1 的值表?特征?常相似。具有相似光谱特征的荧光染料组合包括 BV421/Pacific Blue、Qdot 705/BV711、BB515/FITC、APC/Alexa Fluor 647、PerCP?Cy5.5/PerCP?eFluor 710 和 PerCP?Cy5.5/PE-Cy5.5。这些组合的相似指数分别为 0.66、0.75、0.99、0.89、0.89 和 0.76。对 EDTA 抗凝的人外周?进行染色，裂解红细胞后清洗样品，并在五激光 NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪上进行分析。
NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪生成的光谱密度图和荧光染料的理论发射光谱如图 1 所?，直观地呈现了相似光谱的重叠性和相似性。图 1 中的曲线表明，这些组合中的荧光染料同时使?时能够被区分开来，并且亚群的识别结果不受影响。
虽然光谱解混可以根据荧光染料的光谱特征区分荧光染料信号，但同时测量多种荧光染料时，同样存在光谱溢出扩散误差，?这些溢出扩散误差无法通过光谱解混消除。光谱越接近，两者之间的溢出扩散误差就越?。这种现象提醒我们在 panel 的设计中应选择光谱重叠最?的荧光染料，以减少荧光信号的互相干扰。
2
FITC 与不同相似指数荧光染料组合示例
使? NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪对 FITC 与不同相似指数的荧光染料组合使?的效果进行了?较。这些荧光染料包括 Alexa Fluor 488、KIRAVIA Blue520、Brilliant Blue 515、Alexa Fluor 532 和 APC。这些组合的光谱重叠度逐渐降低，相似指数分别为 1.00、1.00、1.00、0.99、0.56 和 0.08。随着相似指数的降低，荧光扩散误差变?，分辨率提?。当 FITC 与 BB515 组合使?时，相似指数为 0.99，表明这两种染料的光谱几乎完全相同。尽管相似度如此之?，但它们的信号仍然能分辨出来（图 2）。
图 2. FITC 与不同相似指数的荧光染料组合。PBMC 分别? CD3 PE?Cy7 和 FITC、Alexa Fluor 488、KIRAVIA Blue 520、Brilliant Blue 515、Alexa Fluor 532 或 APC 偶联的 CD4 抗体进行染色。将 CD3 PE?Cy7/CD4 FITC 染色的 PBMC 样本与分别? CD3 PE?Cy7 和不同荧光染料偶联的 CD4 抗体标记的样本混合，并在 Agilent NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪（五激光配置）上进行分析。
3
由 405、561 或 637 nm 激光器激发的多种荧光染料组合示例
补偿微球?不同的荧光抗体进行染色，这些标记有荧光染料的微球主要由?种激光（紫色、黄色或红色）激发，然后混合在?起以模拟多色 panel，并在 NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪上进行检测。未混合的单染补偿微球样本用于生成每种荧光染料的光谱特征。光谱解析的结果如图 3 所?。所有群体都可以很好地区分。
图 3. 通过 405、561 或 637 nm 激光器激发的多种发射光谱重叠的荧光染料的解析。(A) 紫色激光器激发的荧光染料组合：BV421、eFluor 450、BV480、BV510、eFluor 506 和 Pacific Orange。(B) 黄色激光器激发的荧光染料组合：PE、CF568、PE?Dazzle 594、PE?Alexa Fluor 610、PE?Fire 640、PE?Cy5、PE-Cy5.5 和 PE?Alexa Fluor 700。(C) 红色激光器激发的荧光染料组合：APC、Alexa Fluor 647、Spark NIR685、APC?R700、Alexa Fluor 700 和 Zombie NIR。
结论
通过采?多组设计测试各种具有相似光谱特性的荧光染料组合，我们证明了安捷伦 NovoCyte Opteon 全光谱流式细胞仪能够有效区分光谱重叠度较?的荧光染料。当?较 FITC 与具有不同程度相似性的荧光染料组合时，我们发现，随着荧光染料相似性的增加，溢出扩散显著增加，从而导致 FITC 的分辨率相应降低。值得注意的是，NovoCyte Opteon 能够区分相似指数?达 0.99 的荧光染料（FITC 和 BB515）。此外，通过使?由额外的 405、561 或 637 nm 激光器激发的多种荧光染料组合验证了 NovoCyte Opteon 的多色解混能?。总之，光谱流式细胞术能够同时使?具有?度重叠光谱的荧光染料，从而增加了荧光染料选择的灵活性。然?，在 panel 设计中必须考虑这些荧光染料之间不可避免的溢出扩散，以确保实验结果的准确性。
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关于安捷伦细胞分析
安捷伦细胞分析平台包括xCELLigence RTCA实时细胞分析仪、NovoCyte系列流式细胞仪、Seahorse能量代谢分析仪以及Synergy系列微孔板检测仪和Cytation 系列（共聚焦）细胞成像多功能微孔板检测仪。安捷伦细胞分析平台聚焦基础科研与细胞与基因治疗产品的开发全流程，作为适配新一代疗法的强大分析工具，提供多方位的细胞效力检测和深度的细胞分析，并致力于研发、生产质控以及临床的全方位检测与分析方案开发。
